HISTOLOGI IKAN (Metode 2)

Histologi adalah ilmu yang mempelajari anatomi jaringan secara mikroskopis, yaitu dengan menggunakan mikroskop untuk mengamatinya.  Ikan adalah organisme multiseluler atau terdiri dari jutaan sel.  Sel-sel tersebut dibedakan satu sama lain serta masing-masing sel memiliki sifat yang khas, karena kelompok sel tersebut dapat melakukan fungsi tertentu.

Kebanyakan jaringan lebih kompleks karena terdiri dari berbagai jenis sel yang berbeda.  Kumpulan dari berbagai jaringan dalam satu kesatuan membentuk organ.  Organ inilah yang merupakan bagian yang tampak pada anatomi luar atau anatomi makro.

Jadi setelah kita mengetahui bahwa anatomi mikro atau histologI adalah mempelajari suatu organ atau bagian tubuh ikan secara lebih cermat, terinci sampai ke tingkat selnya, maka perlu pula diketahui teknik pembuatan preparat histologI tersebut.  Agar sel yang akan diamati seperti asalnya bila ikan dalam keadaan hidup, maka jaringan perlu di cegah agar tidak rusak atau otolisis (kerusakan akibat kerja enzim katabolik).  Semua jaringan tubuh ikan mudah sekali rusak atau otolisis, sehingga langkah utama yang perlu dilakukan adalah mengawetkan jaringan ikan segera setelah dimatikan atau yang sering disebut proses fiksasi.  Tidak disarankan membuat preparat jaringan untuk histologi bila ikan sudah mati.  Langkah-langkah yang perlu dilakukan dan diperhatikan dalam teknik histologi secara manual adalah :

1.     Penentuan jaringan yang akan diamati

2.     Fiksasi atau pengawetan jaringan (Fixation)

3.     Perlakuan  jaringan (processing)

4.     Pemotongan jaringan menggunakan alat mikrotom (Sectioning)

5.     Pewarnaan jaringan (staining)

6.     Pengamatan di bawah mikroskop (Observation)

Ikan yang akan diambil jaringannya, perlu dimatikan lebih dahulu (nekropsi) dengan memotong susunan syaraf pusat di belakang kepalanya.  Bila ikannya sangat aktif, perlu dilakukan pembiusan terlebih dahulu sebelum ikan dimatikan.

1.     Penentuan Jaringan

Penentuan jaringan merupakan salah satu kegiatan yang sangat penting dalam pembuatan preparat jaringan histologi.  Cara memotongnya perlu diperhatikan agar preparat jaringan yang dilihat di bawah mikroskop tampak pada bagian yang sesuai dengan yang diamati.  Kesalahan pemotongan dapat berakibat fatal pada pengamatannya kelak.  Tebalnya jaringan dibuat agar bahan fiksatif dapat meresap sempurna ke dalam jaringan adalah 1 cm.  Jaringan yang sudah dipotong sebesar 1 cm³ langsung dimasukkan ke dalam larutan fiksatif dan disertai dengan label (nama sampel, tanggal, dll).

Bila ukuran ikan kecil, maka seluruh tubuh ikan dimasukkan ke dalam larutan fiksatif, yang sebelumnya bagian perut ikan dibelah agar larutan fiksatif dapat masuk ke dalam dan mengenai organ dalam ikan.  Pemotongan jaringan dilakukan dengan menggunakan pisau skalpel yang tajam.  Pemotongan jaringan dilakukan sekali, tidak berkali-kali dituris agar permukaan rata.  Sangat dianjurkan untuk tidak menggunting jaringan, karena dapat berakibat tertekannya sel oleh gunting sehingga jaringan menjadi mengkerut atau kempis.

  

2.     Fiksasi Jaringan (Fixation)

Jaringan atau organ harus secepatnya dimasukkan ke dalam larutan fiksatif setelah ikan dimatikan dan dibedah.  Tujuan dilakukan proses fiksasi adalah :

1.     Mengawetkan jaringan agar mendekati atau sama seperti keadaan asalnya (normal)

2.     Untuk mencegah terjadinya kerusakan jaringan akibat otolisis ataupun oleh bakteri pembusuk

3.     Mencegah terjadinya proses osmosis dan penciutan jaringan

4.     Melindungi jaringan pada waktu dilakukan proses (perlakuan)

5.     Membentuk tekstur jaringan sehingga memudahkan pada waktu pemotongan

6.     Mengaktifkan jaringan dan komponennya sehingga mudah diwarnai.

Bahan kimia yang dipakai harus memenuhi persyaratan agar dapat berfungsi sebagai larutan fiksatif.  Adapun syaratnya yaitu :

1.     Dapat menyerap (penetrasi) ke dalam jaringan dengan cepat untuk mencegah terjadinya otolisis, pembusukan dan sebagainya

2.     Mengkoagulasikan komponen-komponen sel

3.     Melindungi jaringan terhadap pengkerutan atau kerusakan selama proses pembuatan preparat jaringan lebih lanjut.

Selain pemilihan bahan kimia yang cocok sebagai larutan fiksatif, penting diperhatikan perbandingan volume larutan fiksatif dengan besarnya jaringan yang difiksasi.  Perbandingan larutan fiksatif dengan jaringan yaitu 10 : 1 agar penyerapan larutan fiksatif dapat sempurna ke dalam jaringan.  Sesekali jaringan-jaringan dalam larutan fiksatif dikocok atau dihomogenkan.  Untuk ikan lebih baik bila dilakukan penyimpanan jaringan dalam larutan fiksatif di kulkas suhu 5 – 10 ^oC.

Ada beberapa macam larutan fiksatif yang dapat digunakan, tergantung dari tujuan atau maksud apa yang akan dipelajari dari preparat jaringan tersebut serta macam apa jaringannya.  Pada umumnya larutan fiksatif terdiri dari campuran beberapa bahan kimia yang umum dipakai yaitu 10% Buffer Normal Formalin (BNF) Solution, Bouin’s Solution, Carnoy’s Solution dan beberapa larutan lainnya :

a.     10% Buffer Normal Formalin (BNF) Solution:

-        di-Natrium hydrogen phosphate (Na₂HPO₄)                                               : 6.5 g

-        Natrium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH₂PO₄.H₂O)    : 40 g

-        Formalin 37 – 40 % (Formaldehyde)                                                           : 100 ml

-        Akuades                                                                                            : 900 ml

Na₂HPO₄ (anhydrous) dapat diganti dengan Na₂HPO₄.2H₂O sebanyak 8.15 g untuk setiap 1000 ml 10% BNF.  Setelahg larutan ini dibuat, pH diukur dan diusahakan pH 7.0 atau antara 6.5 – 7.5.  Formaldehyde 37 – 40 % teknis dapat pula dipakai asal larutan masih berwarna jernih dan bila larutan menjadi keruh, maka tidak dapat digunakan sebagi larutan fiksatif karena terbentuk para formaldehyde.  Formaldehyde yang baik memiliki pH 2.8 – 4, dan bila pH kurang dari 2 maka formaldehyde tidak dapat digunakan.

10% BNF adalah larutan fiksatif yang dianjurkan, karena larutan fiksatif ini sebagai buffer untuk mencegah terjadinya asam akibat perubahan formaldehyde menjadi asam format secara perlahan-lahan.  Jika 10% BNF tidak tersedia dilapangan dapat juga digunakan 10% formalin yang terdiri dari formaldehyde 37 – 40% sebanyak 100 ml yang dilarutkan ke dalam 900 ml akuades.  Dan secepatnya spesimen atau sampel jaringan sampai di Laboratorium diganti dengan larutan fiksatif 10% BNF.  Waktu minimal yang dibutuhkan untuk jaringan dalam larutan fiksatif adalah 24 jam dan maksimal 1 minggu.  Jaringan masih dapat disimpan dalam pengawet ini untuk jangka waktu beberapa bulan atau tahun dengan resiko terjadinya penurunan kualitas warna pada inti sel.  Larutan fiksatif 10% BNF ini dapat digunakan untuk mengawetkan bermacam-macam jaringan termasuk jaringan syaraf.

b.     Bouin’s Solution :

A.     Picric acid jenuh (1000 ml):              

-        Picric acid                                                : 30 g

-        Akuades                                      : 1000 ml

B.     Larutan Bouin’s (1000 ml) :

-        Picric acid jenuh (A)                    : 800 ml

-        Formaldehyde 37 – 40 %                        : 150 ml

-        Acetic acid glacial 100 %            :   50 ml

Larutan fiksasi Bouin’s sangat baik digunakan untuk pengawetan jaringan ikan terutama tenunan ikat, glikogen dan otot.  Kerugian dari fiksatif ini dapat menyebabkan sel-sel darah merah lysis dan terjadinya pembengkakan dari serabut-serabut kolagen serta menyebabkan jaringan berwarna kuning.  Lamanya waktu pengawetan 24 jam dan sesudah itu secepatnya dipindahkan ke alkohol 70 %.  Larutan Bouin’s juga sangat baik digunakan untuk pewarnaan spesifik trichromes.

Larutan Bouin’s dibuat dengan perbandingan picric acid jenuh : formaldehyde : acetic acid glacial adalah 16 : 3 : 1.  Larutan Bouin’s bisa tahan lama sekitar 6 bulan jika terhindar dari keadaan yang dingin dan kelebihan panas.  Jaringan tidak boleh lebih lama dari 24 – 48 jam di dalam larutan Bouin’s.  Selanjutnya jaringan harus dipindahkan ke dalam alkohol 70 % selama ≥ 2 jam sampai beberapa hari, kemudian jaringan dipindahkan ke :

-        Alkohol 85 %             : selama 1 jam

-        Alkohol 90 %             : selama 2 jam

-        Alkohol 85 %             : selama 1 jam

-        Alkohol 70 %             : selama 2 jam

-        Jaringan dibilas dengan air kran mengalir pelan selama ± 2 jam

-        Jaringan yang mengandung calcium, harus didekalsifikasi dahulu menggunakan larutan Decalcification selama 24 jam.  Hal ini bertujuan agar calcium yang ada di jaringan hilang, sehingga mempermudah pada saat pemotongan

-        Jaringan dibilas lagi dengan air kran mengalir pelan selama ± 2 jam

-        Pindahkan ke alkohol 70 %  lagi selama ≥ 2 jam atau sampai beberapa hari

Sekarang jaringan siap untuk dilakukan Processing.

3.     Proses (perlakuan) jaringan (Processing)

Proses jaringan terdiri dari dari 5 tahap, yaitu :

1.     Dehidrasi

2.     Clearing

3.     Impregnasi

4.     Embedding

5.     Blocking

Proses jaringan ini bertujuan agar jaringan yang umumnya lunak nantinya dapat dipotong setebal 2 – 4 mm, diwarnai dan dilihat bentuk selnya di bawah mikroskop.  Bila potongan jaringan lebih tebal, maka bentuk sel dari jaringan tersebut tidak jelas karena terjadi penumpukan atau saling tindih menindih sel yang satu dengan lainnya.  Untuk memungkinkan dibuat potongan yang sedemikian tipis, dan jaringan perlu diikat dalam parafin.  Agar ikatan dalam parafin tidak mudah lepas, maka perlu dilakukan beberapa tahapan proses pembuatannya :

A.     Dehidrasi

Proses ini dimaksudkan agar cairan di dalam sel atau jaringan ditarik keluar, untuk akhirnya diganti parafin.  Penarikan air keluar dari sel dilakukan dengan cara merendam jaringan dalam bahan kimia yang fungsinya sebagai penarik air.  Bahan kimia yang dipakai adalah alkohol, acetone, methanol, diazone, isopropanol dan butanol.  Untuk proses dehidrasi pada pembuatan preparat jaringan histologi secara manual yang sering digunakan adalah alkohol.  Caranya, jaringan yang direndam dalam alkohol 70 % selama ≥ 2 jam sampai beberapa hari tersebut secara bertahap dipindahkan ke dalam :

-        Alkohol 85 %             : selama 1 jam

-        Alkohol 95 %             : selama 1 jam

-        Alkohol 100 %           : selama 2 jam

Alkohol absolut 100 % dibuat dari alkohol 99 % yang ditambahkan cupper sulfate (CuSO₄) sedikit demi sedikit sampai larutan menjadi bening (tidak keruh).

B.     Clearing

Pada proses clearing, jaringan kemudian dipindahkan ke dalam :

-        Alkohol – xylene (1 : 1)        : selama 1 jam

-        Xylene                                   : selama 1 jam

-        Xylene 2                                : selama 1 jam

-        Xylene 3                                : selama 1 jam

Proses ini bertujuan agar jaringan sesudah dehidrasi, air di dalam sel keluar.  Bagian sel yang kosong nantinya dapat didisi parafin, agar jaringan terikat kuat dengan parafin.  Tetapi alkohol tidak melarutkan ataupun bersatu dengan parafin, oleh karena itu digunakan xylene yang dapat melarutkan parafin maupun dapat bercampur dengan alkohol.  Jadi proses clearing maksudnya mengganti tempat air sel yang sudah diganti oleh alkohol untuk diganti dengan xylene.  Agar proses sempurna dilakukan 2 kali perendaman dengan xylene.

C.     Impregnasi

Impregnasi adalah proses penggantian xylene dengan parafin.  Setelah dalam xylene 2 selama 1 jam, jaringan dipindahkan dalam xylene : parafin (1 : 1) selama 1 jam (di dalam oven).  Proses impregnasi dilakukan di dalam oven dengan suhu 60 – 65 ^oC.  Parafin yang digunakan biasanya memiliki titik cair 56 – 58 ^oC.

D.    Embedding

Proses embedding bertujuan agar xylene benar-benar telah seluruhnya diganti dengan parafin.  Setelah dari tahap impregnasi kemudian jaringan dipindahkan ke dalam :

-      Parafin 1                     : selama 1 jam

-      Parafin 2                     : selama 1 jam

-      Parafin 3                     : selama 1 jam

E.     Blocking

Setelah dikeluarkan dari parafin 2 kemudian jaringan dicetak dalam cetakan, ini dinamakan proses blocking.  Dalam cetakan, jaringan disusun dan bagian potongan yang diperlukan menghadap dasar cetakan.  Ini merupakan cara yang perlu diperhatikan karena salah meletakkan maka, potongan jaringan yang akan didapat tidak sesuai dengan yang diinginkan.  Biarkan jaringan terikat parafin selama 1 malam, tetapi diperhatikan agar didalam blok terutama disekitar jaringan tidak ada udara, sehingga ikatan jaringan dalam parafin kuat.  Setelah blok menjadi keras, keesokan harinya blok dikeluarkan dari cetakan untuk selanjutnya siap dipotong dengan alat mikrotom.

4.     Pemotongan jaringan (section)

Setelah mikrotom diset untuk ketebalan tertentu, jaringan lalu dipotong.  Biasanya untuk jaringan lunak dipotong tipis dengan ketebalan 2 – 4 mm, misalnya untuk jaringan atau organ daging, hati, ginjal, limfa, otak, usus dan sebagainya.  Sedangkan untuk jaringan keras dipotong lebih tebal yaitu 7 – 8 mm.  Pemotongan diusahakan agar sambung-menyambung berbentuk pita jaringan.  Selanjutnya potongan pita jaringan diletakkan di atas gelas objek, yang sebelumnya gelas objek sudah diolesi dahulu dengan cairan perekat putih telur (terbuat dari putih telur yang dilarutkan ke dalam air).  Proses perekatan jaringan ini dilakukan di atas hot plate dengan suhu ± 50 ^oC agar pita jaringan teregang dan kering, untuk selanjutnya jaringan diwarnai.

5.     Pewarnaan jaringan (staining)

Setelah dipotong, jaringan masih mengandung paraffin untuk itu harus dihilangkan dengan merendamnya ke dalam xylene.  Agar dapat diwarnai dengan zat warna yang larut dalam air, maka dilakukan proses hidrasi.  Gelas objek yang berisi jaringan kemudian dimasukkan ke dalam :

-        Petroleum Benzene                                      : selama 3 menit

-        Xylene                                                           : selama 3 menit

-        Alkohol 100 % (1)                                         : selama 3 menit

-        Alkohol 100 % ( 2)                                        : selama 3 menit

-        Alkohol 95 %                                                 : selama 3 menit

-        Alkohol 85 %                                                 : selama 3 menit

-        Alkohol 70 %                                                             : selama 3 menit

-        Alkohol 60 %                                                 : selama 3 menit

-        Cuci dengan air kran                                    : selama 10 detik

-        Cuci dengan akuades                                               : selama 5 detik

Warnai dengan Haematoxylin (H):

-        Haematoxylin solution                                : selama 10 - 30 menit

-        Cuci dengan air kran mengalir pelan                      : selama 5 - 20 menit

-        Cuci dengan akuades                                               : selama 5 detik

Warnai dengan Eosin (E):

-        Eosin solution                                               : selama 1 - 5 menit

-        Cuci dengan air kran mengalir pelan                      : selama 10 detik

-        Cuci dengan akuades                                               : selama 5 detik

Sesudah dicuci, kembali dilakukan dehidrasi agar selanjutnya dapat direkatkan dengan gelas penutup dan zat perekat (mounting medium), caranya masukkan gelas objek dan jaringannya ke dalam :

-        Alkohol 70 %                                     : selama 5 detik

-        Alkohol 80 %                                     : selama 5 detik

-        Alkohol 95 %                                     : selama 5 detik

-        Alkohol 100 %                                   : selama 1 - 3 menit

-        Creosote : Xylene (1:1)                     : selama 1 - 3 menit

-        Xylene                                               : selama 1 - 3 menit

Selanjutnya gelas objek dan jaringan di atasnya ditetesi dengan canada balsam atau entellan dan langsung ditutup dengan gelas penutup.  Biarkan semalam agar kering dan tidak ada udara antara gelas penutup dan gelas objek.  Sekarang preparat jaringan sudah dapat diamati di bawah mikroskop.

 

BAHAN-BAHAN

1.     BOUIN’S Solution :

1.     Picric Acid jenuh (Saturated Picric Acid) :

-        Picric Acid (C₆H₃N₃O₇)                                                   : 30 g

-        Akuades                                                                         : 1000 ml

2.     Bouin’s Solution (100 ml):

-        Saturated Picric Acid                                                     : 80 ml

-        Formaldehyde 37 %                                                      : 15 ml

-        Acetic Acid Glacial (CH₃COOH)                                     : 5 ml

2.     Decalcification Solution (200 ml):

1.     Larutan A :

-        Formic Acid 90% (HCOOH)                                            : 50 ml

-        Akuades                                                                         : 50 ml

2.     Larutan B :

-        tri-Sodium Citrate dihydrate (C₆H₅Na₃O₇ . 2H₂O)       : 20 g

-        Akuades                                                                         : 100 ml

**Larutan B distirer selama 30 menit sampai larut.  Kemudian larutan A dan Larutan B dicampur dan distirer lagi.

3.     Hematoxylin Solution (1000 ml) :

-        Hematoxylin (C₁₆H₁₄O₆.H₂O)                                                           : 1 g

-        Natrium Iodate (NaIO₃)                                                       : 0.2 g

-        Aluminium Potassium Sulfat (KAl(SO₄)₂.12H₂O)                 : 50 g

-        Chloral Hydrate (C₂H₃Cl₃O₂)                                                            : 50 g

-        Citric Acid Monohydrate (C₆H₈O₇ . H₂O)                             : 1 g

-        Akuades                                                                                : 1000 ml

4.     Eosin Solution (100 ml):

-        Eosin (C₂₀H₆Br₂N₂Na₂O₉)                                                      : 0.5 – 1 g

-        Akuades                                                                                : 100 ml