KULTUR MURNI Nannochloropsis sp. di LABORATORIUM

I. PERSIAPAN ALAT

1) Tabung reaksi (test tube) 23 ml, erlenmeyer 500 ml, erlenmeyer 3000 ml, erlenmeyer 5000 ml, toples kaca 2500 ml, selang aerasi dan batu aerasi dicuci dengan menggunakan deterjen/sunlight, kemudian dibilas hingga bersih.

2)  Setelah dicuci alat-alat gelas, selang aerasi dan batu aerasi, corong, dan tutup plastik direndam dalam larutan chlorin (NaOCl) 150 ppm selama 1 hari (setelah itu dinetralkan dengan Na-thiosulfat/Na₂S₂O₃ 5 ppm) + HCl 0.1% atau 1 ml HCl/L air tawar)

      Contoh :

- 10 L air tawar + chlorin 1.5 ml (larutkan dan diamkan selama 1 hari)   kemudian tambahkan Na-thiosulfat 1 butir

-   Tambahkan HCl 20 ml

(Rendaman HCl diganti dengan yang baru setiap 3 hari sekali)

(Setelah test tube dan Erlenmeyer 500 ml direndam seharian, setelah itu tuang rendaman HCl ke erlenmeyer 3000 ml dan 5000 ml, biarkan seharian)

3)  Keringkan alat-alat gelas tersebut dan taruh di rak

4)  Setelah kering alat-alat siap digunakan

II. STERILISASI AIR

1)  Air laut yang digunakan berasal dari air yang melewati ultraviolet/UV yang kemudian difilter dengan menggunakan cartridge filter berseri dari mesh size 1 μm (karet hitam) sampai 0.45 μm

2)  Air laut sebelum masuk cartridge filter harus di back wash (dibuang dulu sekitar 15 menit), setelah itu baru dialirkan ke cartridge filter.

3)  Air laut kemudian dimasukkan ke dalam test tube sebanyak 13 ml (24 test tube) menggunakan pipet mohr, 380 ml air laut ke dalam erlenmeyer 500 ml, 2500 ml air laut ke dalam erlenmeyer 3000 ml, 4500 ml air laut ke dalam erlenmeyer 5000 ml, dan 2000 ml air laut ke dalam toples kaca 2500 ml.

4)   Tutup erlenmeyer dengan plastik kemudian ikat menggunakan karet gelang

5)  Pipet mohr (5 ml dan 10 ml), pipet tetes tanpa bulb karet (4 buah), kapas penutup yang dibungkus plastik (4 buah), selang aerasi (4 buah), batu aerasi (4 buah), beserta test tube (24 buah), dan erlenmeyer (500, 3000 dan 5000 ml) yang berisi air laut, toples kaca 2500 ml serta 800 ml air tawar dierlenmeyer 1000 ml (untuk pembuatan rendaman pipet tetes) di autoclave pada suhu 121 ^oC, tekanan 15 psi selama 15 menit atau bisa juga direbus selama 1 jam dengan api sedang sampai mendidih (sore hari).  Sedangkan toples kaca 2500 ml di bilas dengan air panas/mendidih dua kali.  Dan terakhir toples diisi air laut yang sudah direbus sebanyak 2000 ml.  Selang aerasi dan tutup untuk toples juga ikut direbus.

6) Biarkan alat-alat gelas dan selang aerasi di dalam autoclave dan atau di dalam dandang semalaman. Kemudian dipindahkan ke ruang kultur (pagi hari). Pipet mohr, pipet tetes, selang aerasi dan batu aerasi, kapas penutup dimasukkan ke wadah tertutup steril (wadah sebelumnya disemprot dulu dengan alkohol 70%)

7)  Setelah dingin, air siap digunakan untuk kultur

III. KULTUR Nannochloropsis sp.

1)     Selama kultur harus aseptik, menyemprot meja dan tangan dengan alkohol 70%, menggunakan api bunsen, memakai masker dan mematikan AC

2)     Pemupukan atau pemberian Vitamin mix, pupuk Conwy/Walme (1 ml /L media, menggunakan pipet mohr steril)

-        Tabung reaksi/test tube 23 ml              :  1 tetes (dgn pipet tetes)

-        Erlenmeyer 500 ml                               :  0.5 ml pupuk

-        Erlenmeyer 3000 ml                             :  3 ml pupuk

-        Erlenmeyer 5000 ml                             :  5 ml pupuk

-        Toples kaca 2500 ml                            : 2.5 ml pupuk

3)     Inokulasi : pemberian inokulan/bibit murni Nannochloropsis sp. ke dalam media kultur

a.      Inokulan awal (bibit/starter) Nannochloropsis sp.  sebanyak 10-20% dari volume media atau kepadatan awal yang digunakan 3 – 4 juta sel/ml (3 – 4 x 10⁶ sel/ml)

b.     -  Tabung reaksi 23 ml : diberi inokulan dari test tube sebanyak ±4 ml          (dituang dari test tube ke test tube)

-        Erlen 500 ml : diberi inokulan dari test tube sebanyak 110 ml (dari 12 test tube 23 ml)

-        Erlen 3000 ml : diberi inokulan dari erlenmeyer 500 ml

-        Erlen 5000 ml : diberi inokulan dari erlenmeyer 500 ml

-        Toples 2500 ml : diberi inokulan dari erlenmeyer 3000 ml

4)     Inkubasi Nannochloropsis sp. selama 6 hari

Aerasi :

   -  Erlenmeyer : pemberian aerasi sedang

     - Test tube : cukup dibolak-balik sebanyak 3x, setiap pagi, siang dan sore hari

5)     Observasi (kualitas dan kuantitas Nannochloropsis sp.)

Kualitas  : Pengamatan terhadap bentuk sel, klorofil dan kontaminasi dari protozoa maupun algae yang lain

Kuantitas  :   Penghitungan jumlah sel/ml dengan Haemocytometer

     

RENDAMAN UNTUK PIPET TETES

• Setelah direbus pipet tetes kemudian ditempatkan pada rendaman HCl 0.1%
• Pembuatan rendaman yaitu masukkan 200 ml air tawar steril (sudah direbus) ke dalam aqua gelas, kemudian tambahkan 15 tetes HCl
• Rendaman HCl diganti dengan yang baru setiap 3 hari sekali (sebelum kultur)

LAIN-LAIN

• Stok murni Nannochloropsis sp. (cair) disimpan di kulkas 4^oC dan setiap 1 bulan sekali diperbaharui lagi
• Panci dicuci dengan sabun setelah digunakan
• Setiap 7 hari sekali, cartridge filter di rendam dengan chlorine 10% baru direndam deterjen, kemudian dibilas dengan air tawar, terakhir dijemur sampai kering.  Meja dan rak kultur dibersihkan, serta Lab. Dipel setiap 2 hari sekali.